Seminário: Tecnologia do DNA recombinante

1. Introdução A Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Um exemplo seria o isolamento, extração e o enxerto de gene humano para a produção de insulina em bactérias da espécie Escherichia coli. Essas bactérias, contendo o gene humano, multiplicam-se quando cultivadas em laboratórios, produzindo insulina, o que atualmente é realizado em grande escala.

2. Vetores utilizados em Engenharia Genética 2.1 - Plasmídeo bacteriano As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biológicos empregados na Tecnologia do DNA Recombinante. Isto se deve a vários fatores: - ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores. - cultivo de um grande número de indivíduos em um espaço pequeno - apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores - divisão celular por fissão binária. Além do DNA cromossômico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas PLASMÍDEOS. Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas. Em Engenharia Genética, genes "estranhos" a bactéria podem ser incorporados aos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam. Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria. Os plasmídeos portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência). Eles possuem também, genes que permitem sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência). Quando dois ou mais tipos de plasmídeos R estão presentes em uma mesma bactéria, os genes de um deles pode passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídeos R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos. Essa propriedade de genes para resistência a antibióticos passarem de uma molécula de DNA para outra fez com que os cientistas os classificasse de transposons ou genes saltadores. 2.2 - Vírus Os vírus, principalmente o bacteriófago conhecido como fago lambda, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante. O fago lambda possui genes essenciais que são indispensáveis à reprodução, e também genes não essenciais, cuja presença é dispensável a multiplicação viral. Os genes essenciais produzem as proteínas da cápsula e as enzimas que atuam na duplicação do DNA viral. Esses genes estão localizados nas extremidades do cromossomo do vírus. Entretanto, os genes não essenciais estão relacionados aos processos de recombinação entre moléculas de DNA, e se localizam na região mediana do cromossomo viral, sem interferir na reprodução do vírus, sendo portanto dispensáveis. A região mediana do cromossomo, onde se localizam os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado. Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias o que é necessário ao estudo de genes. 2.3 - Lipossomos São essencialmente esferas de membrana sintética formadas por camadas bilipídicas preenchidas com DNA. Eles se fundem espontaneamente com a membrana celular, liberando seu conteúdo no citoplasma. Apresentam a vantagem de nunca causar doença alguma, porém apresentam pouca eficiência.

3. Tecnologia do DNA Recombinante Em Engenharia Genética a expressão DNA RECOMBINANTE designa o resultado obtido a partir de pedaços de DNA de fontes diferentes ligados entre si. As vezes, o DNA provém de dois organismo diferentes, como é o caso do gene para insulina ligado ao DNA e da bactéria. Outras vezes, um pedaço de DNA de um organismo pode ser ligado a um DNA sintético produzido em laboratório pela junção de nucleotídeos na seqüência desejada. Para se conseguir DNA recombinante, é preciso cortar as moléculas de DNA que se quer recombinar e em seguida, "colar" suas extremidades. Para isso, os pesquisadores contam com ferramentas extremamente úteis chamadas ENZIMAS DE RESTIÇÃO. Esses enzimas são obtidas de bactérias que as produzem naturalmente para se defenderem da invasão de alguns vírus. Isso é possível devido a propriedade que essas enzimas apresentam, de picotar o DNA de dupla hélice do invasor em certos pontos específicos. Portanto, cada tipo de enzima de restrição corta uma região específica do DNA.

3.1 - Obtenção de Genes para Enxerto Há na realidade três formas fundamentais para obtermos genes para enxerto: criar-se a chamada "biblioteca" de genes, fabricar-se o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro ou sintetizar-se o gene, nucleotídeo por nucleotídeo, na seqüência desejada. · Biblioteca de genes Uma biblioteca de genes é uma coleção de um grande número de fragmentos de DNA do genoma. Cada fragmento, contendo apenas um gene é inserido em um vetor, que pode ser um plasmídeo bacteriano ou um fago. · Síntese do gene através do RNA mensageiro Às vezes o pesquisador dispõe do RNA mensageiro responsável pela codificação de determinada proteína. A partir desse RNA, pode ser fabricado em laboratório um segmento de DNA com uma seqüência complementar. Esse DNA, evidentemente, terá uma seqüência idêntica a do gene que produziu originalmente o RNA mensageiro. Um dos trunfos nessa técnica é utilização de uma enzima chamada transcriptase reversa, que permite a produção de DNA a partir de uma molécula de RNA. O DNA assim produzido é chamado de cDNA ou DNA complementar. · Síntese do gene por adição de nucleotídeos Isso é feito normalmente para genes que codificam polipeptídeos ou proteínas de pequeno tamanho. Suponha que conheçamos a seqüência de aminoácidos de um pequeno polipeptídeo. Cada aminoácido, você deve se lembrar, é codificado por uma seqüência de três nucleotídeos de DNA, chamada códon. Basta utilizar a tabela do código já conhecida para sermos capazes de construir uma seqüência de nucleotídeos que corresponda exatamente à seqüência de aminoácidos da proteína. 3.2 - Enzimas de Restrição A base da técnica do DNA recombinante é a utilização de enzimas de restrição. Essas enzimas são capazes de cortar uma molécula de DNA em locais bem específicos, ou seja, cada tipo de enzima de restrição reconhece apenas uma certa seqüência de nucleotídeos e efetua o corte somente ao encontrar essa seqüência na molécula de DNA. Cada bactéria tem suas próprias enzimas de restrição e cada enzima reconhece apenas um tipo de seqüência, independentemente da fonte do DNA. O esquema a seguir, explica melhor o fenômeno e demonstra a técnica de se enxertar um pedaço de DNA estranho (gene) num plasmídeo bacteriano. O gene a ser enxertado pode ser obtido de animal, de planta ou ser preparado em laboratório. Repare que tanto o plasmídeo quanto o pedaço de DNA a ser enxertado têm que ser submetidos à mesma enzima de restrição, que os cortará em regiões com a mesma seqüência, de forma a aparecerem extremidades soltas complementares que possam se soldar. O resultado é o DNA recombinante constituído do plasmídeo e do gene novo enxertado. 3.3 - DNA recombinante O DNA recombinante é uma molécula híbrida obtida pela união de DNAs de fontes biologicamente diferentes. Esses segmentos de DNAs de organismos diferentes são cortados pela mesma enzima de restrição e unidos pela enzima DNA ligase, produzindo dessa forma uma molécula híbrida, que é o DNA recombinante. 3.4 - Clonagem molecular Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é inseri-los em células bacterianas. Plasmídeos e células bacterianas são postos um em contato com o outro. No entanto, apenas algumas bactérias conseguem absorver o plasmídeo novo, sendo necessário agora, selecionar na população de bactérias aquelas que realmente incorporaram o plasmídeo com o gene novo. Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico. Em seguida, esses plasmídeos são abertos, e os genes a serem enxertados são encaixados. Esses plasmídeos são colocados em contato com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam. Para selecionar as bactérias que ganharam o plasmídeo novo basta adicionar o antibiótico ao meio de cultivo. Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, por não serem resistentes ao antibiótico, restando somente as que possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico. Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo. 3.5 - Expressão de genes clonados em bactérias Tão logo foram desenvolvidas as técnicas básicas de clonagem molecular, os biólogos concluíram que um gene de interesse, se estivesse ligado a um plasmídeo e fosse introduzido em uma bactéria, poderia eventualmente funcionar. As bactérias portadoras desse gene se transformariam em verdadeiras fábricas, produzindo quantidades ilimitadas de proteínas que o gene codifica. A primeira vez que se obteve síntese de uma proteína humana por uma bactéria transformada foi em 1977. Um segmento de DNA de 60 pares de bases, contendo o código para a síntese da somatotrofina (hormônio de crescimento). Foi ligado a um plasmídeo e introduzido em uma bactéria, a partir da qual foram obtidos clones capazes de produzir somatotrofina. Outros genes que codificam proteínas de interesse médico têm sido transplantados para bactérias, onde passam a funcionar. Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.